Slanggif bevat ensieme wat karboksielesterbindings hidroliseer.Die substrate vir hidrolise is fosfolipiede, asetielcholien en aromatiese asetaat.Hierdie ensieme sluit drie soorte in: fosfolipase, asetielcholienesterase en aromatiese esterase.Arginienesterase in slanggif kan ook sintetiese arginien of lisien hidroliseer, maar dit hidroliseer hoofsaaklik proteïenpeptiedbindings in die natuur, dus behoort dit aan protease.Die ensieme wat hier bespreek word, werk slegs op estersubstrate en kan nie op enige peptiedbinding inwerk nie.Onder hierdie ensieme is die biologiese funksies van asetielcholienesterase en fosfolipase belangriker en is volledig bestudeer.Sommige slanggifstowwe het sterk aromatiese esterase-aktiwiteit, wat p-nitrofenieletielester, 'n – of P-naftaleenasetaat en indooletielester kan hidroliseer.Dit is nog onbekend of hierdie aktiwiteit geproduseer word deur 'n onafhanklike ensiem of 'n bekende newe-effek van karboksielesterase, wat nog te sê van die biologiese betekenis daarvan.Toe die gif van Agkistrodon halys Japonicus met p-nitrofenieletielester en indooletielester gereageer is, is die hidrolisate van p-nitrofenol en indoolfenol nie gevind nie;Inteendeel, as hierdie esters reageer met die kobra Zhoushan subspesie slanggif en Bungarus multicinctus slanggif, sal hulle vinnig gehidroliseer word.Dit is bekend dat hierdie kobra-gifstowwe sterk cholinesterase-aktiwiteit het, wat verantwoordelik kan wees vir hidrolise van bogenoemde substrate.Trouens, Mclean et al.(1971) het berig dat baie slanggif wat aan die Cobra-familie behoort, indool-etielester, naftaleen-etielester en butielnaftaleenester kan hidroliseer.Hierdie slanggifstowwe kom van: kobra, swartnekkobra, swartlipkobra, goue kobra, Egiptiese kobra, koningskobra, goue kobramamba, swartmamba en witlipmamba (D. aw ken steeds oostelike rhombola ratelslang
Die slanggif kan metielindool-etielester hidroliseer, wat die substraat is vir die bepaling van die cholinesterase-aktiwiteit in serum, maar hierdie slanggif toon nie cholinesterase-aktiwiteit nie.Dit wys dat daar 'n onbekende esterase in kobragif is, wat verskil van cholinesterase.Om die aard van hierdie ensiem te verstaan, is verdere skeidingswerk nodig.
1, Fosfolipase A2
(I) Oorsig
Fosfolipase is 'n ensiem wat gliserielfosfaat kan hidroliseer.Daar is 5 soorte fosfolipase in die natuur, naamlik fosfolipase A2 en fosfolipase
A. , fosfolipase B, fosfolipase C en fosfolipase D. Die slanggif bevat hoofsaaklik fosfolipase A2 (PLA2), 'n paar slanggifstowwe bevat fosfolipase B, en ander fosfolipases word hoofsaaklik in diereweefsel en bakterieë aangetref.Fig. 3-11-4 toon die werkplek van hierdie fosfolipases op substraathidrolise.
Onder fosfolipases is PLA2 meer bestudeer.Dit is dalk die ensiem wat die meeste bestudeer is in slanggif.Die substraat daarvan is die esterbinding op die tweede posisie van Sn-3-gliserofosfaat.Hierdie ensiem word wyd aangetref in slanggif, byegif, skerpioengif en diereweefsel, en PLA2 is volop in vier familieslanggifstowwe.Omdat hierdie ensiem rooibloedselle breek en hemolise veroorsaak, word dit ook "hemolisien" genoem.Sommige mense noem ook PLA2 hemolitiese lesitinase.
Ludeeke het eers gevind dat slanggif 'n hemolitiese verbinding kan produseer deur deur middel van ensieme op lesitien in te werk.Later het Delezenne et al.het bewys dat wanneer kobragif op perdeserum of eiergeel inwerk, dit 'n hemolitiese stof vorm.Dit is nou bekend dat PLA2 direk op die fosfolipiede van die eritrosietmembraan kan inwerk, wat die struktuur van die eritrosietmembraan vernietig en direkte hemolise veroorsaak;Dit kan ook op serum of bygevoegde lesitien inwerk om hemolitiese lesitien te produseer, wat op rooibloedselle inwerk om indirekte hemolise te produseer.Alhoewel PLA2 volop in die vier families van slanggifstowwe voorkom, verskil die inhoud van ensieme in verskeie slanggifstowwe effens.Ratelslang (C
Slanggif het slegs swak PLA2-aktiwiteit getoon.Tabel 3-11-11 illustreer die vergelyking van PLA2-aktiwiteit van 10 hoofgifstowwe van giftige slange in China.
Tabel 3-11-11 Vergelyking van fosfolipase VIII-aktiwiteite van 10 slanggif in China
Slanggif
Vet vrystelling
Alifatiese suur,
Cjumol/mg)
Hemolitiese aktiwiteit CHU50/^ g * ml)
Slanggif
Laat vetsure vry
(^raol/mg)
Hemolitiese aktiwiteit “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
elf
Micracephal ophis
vyf punt een nul
kalyspallas
8. 68
tweeduisend-agthonderd
gracilis
V, akutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
drie punt agt twee
honderd en veertig
Bnugarus fasctatus
7,56
tweehonderd-en-tagtig
B. multicinctus
een punt nege ses
tweehonderd-en-tagtig
Adder en russelli
sewe punt nul drie
T, mucrosquamatus
een punt agt vyf
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Skeiding en suiwering
Die inhoud van PLA2 in slanggif is groot, en dit is stabiel teen hitte, suur, alkali en denaturant, sodat dit maklik is om PLA2 te suiwer en te skei.Die algemene metode is om eers jelfiltrasie op die ru-gif uit te voer, dan ioonuitruilchromatografie uit te voer, en die volgende stap kan herhaal word.Daar moet kennis geneem word dat die vriesdroging van PLA2 na ioonuitruilchromatografie nie aggregasie behoort te veroorsaak nie, omdat die vriesdroogproses dikwels die ioniese sterkte in die sisteem verhoog, wat 'n belangrike faktor is wat aggregasie van PLA2 veroorsaak.Benewens bogenoemde algemene metodes, is die volgende metodes ook aangeneem: ① Wells et al.② Die substraatanaloog van PLA2 is as ligand vir affiniteitschromatografie gebruik.Hierdie ligand kan met Ca2+ in slanggif aan PLA2 bind.EDTA word meestal as eluent gebruik.Nadat Ca2+ verwyder is, neem die affiniteit tussen PLA2 en ligand af, en dit kan van ligand gedissosieer word.Ander gebruik 30% organiese oplossing of 6mol/L ureum as eluent.③ Hidrofobiese chromatografie is uitgevoer met PheiiylSephar0SeCL-4B om spoor PLA2 in kardiotoksien te verwyder.④ Anti-PLA2-teenliggaampies is as ligand gebruik om affiniteitschromatografie op PLA2 uit te voer.
Tot dusver is 'n groot aantal slanggif PLAZ gesuiwer.Tu et al.(1977) het PLA2 gelys wat van slanggif gesuiwer is voor 1975. In onlangse jare is daar elke jaar 'n groot aantal artikels oor skeiding en suiwering van PLA2 gerapporteer.Hier fokus ons op die skeiding en suiwering van PLA deur Chinese geleerdes.
Chen Yuancong et al.(1981) het drie PLA2 spesies geskei van die gif van Agkistrodon halys Pallas in Zhejiang, wat volgens hul iso-elektriese punte in suur, neutrale en alkaliese PLA2 verdeel kan word.Volgens sy toksisiteit is neutrale PLA2 meer toksies, wat geïdentifiseer is as presinaptiese neurotoksien Agkistrodotoksien.Alkaliese PLA2 is minder giftig, en suur PLA2 het byna geen toksisiteit nie.Wu Xiangfu et al.(1984) het die kenmerke van drie PLA2's vergelyk, insluitend molekulêre gewig, aminosuursamestelling, N-terminaal, iso-elektriese punt, termiese stabiliteit, ensiemaktiwiteit, toksisiteit en hemolitiese aktiwiteit.Die resultate het getoon dat hulle soortgelyke molekulêre gewig en termiese stabiliteit gehad het, maar beduidende verskille in ander aspekte gehad het.In die aspek van ensiemaktiwiteit was suur ensiemaktiwiteit hoër as alkaliese ensiemaktiwiteit;Die hemolitiese effek van alkaliese ensiem op rot rooibloedselle was die sterkste, gevolg deur neutrale ensiem, en suur ensiem wat skaars gehemoliseer is.Daarom word daar gespekuleer dat die hemolitiese effek van PLAZ verband hou met die lading van PLA2-molekule.Zhang Jingkang et al.(1981) het Agkistrodotoksien-kristalle gemaak.Tu Guangliang et al.(1983) berig dat 'n toksiese PLA met 'n iso-elektriese punt van 7. 6 geïsoleer en gesuiwer is uit die gif van Vipera rotundus van Fujian, en sy fisiese en chemiese eienskappe, aminosuursamestelling en die volgorde van 22 aminosuurreste by die N -terminaal is bepaal.Li Yuesheng et al.(1985) het 'n ander PLA2 van die gif van Viper rotundus in Fujian geïsoleer en gesuiwer.Die subeenheid van die PLA2 * is 13 800, die iso-elektriese punt is 10,4, en die spesifieke aktiwiteit is 35/xnioI/miri mg。 Met lesitien as die substraat is die optimale pH van die ensiem 8,0 en die optimale temperatuur is 65 ° C LD5 binneaars ingespuit in muise.Dit is 0,5 ± 0,12mg/kg.Hierdie ensiem het duidelike antikoagulante en hemolitiese effekte.Die giftige PLA2-molekule bestaan uit 123 residue van 18 soorte aminosure.Die molekule is ryk aan sisteïen (14), asparaginsuur (14) en glisien (12), maar bevat net een metionien, en die N-terminaal daarvan is serienresidu.In vergelyking met PLA2 wat deur Tuguang geïsoleer is, is die molekulêre gewig en die aantal aminosuurreste van die twee isoensieme baie soortgelyk, en die aminosuursamestelling is ook baie soortgelyk, maar die aantal asparaginsuur- en prolienresidu is ietwat anders.Guangxi koningskobra-slanggif bevat ryk PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) het 'n PLA2 uit die gif geïsoleer, wat 'n spesifieke aktiwiteit 3.6 keer hoër as die oorspronklike gif het, 'n molekulêre gewig van 13000, 'n samestelling van 122 aminosuurreste, 'n iso-elektriese punt van 8.9 en goeie termiese stabiliteit.Uit die elektronmikroskoop waarneming van die effek van basiese PLA2 op rooibloedselle, kan dit gesien word dat dit 'n duidelike effek op menslike rooibloedselmembraan het, maar geen ooglopende effek op bokrooibloedselle het nie.Hierdie PLA2 het 'n duidelike vertraagde effek op die elektroforetiese spoed van rooibloedselle in mense, bokke, hase en proefkonyne.Chen et al.Hierdie ensiem kan bloedplaatjie-aggregasie wat deur ADP, kollageen en natriumarakidonsuur veroorsaak word, inhibeer.Wanneer PLA2-konsentrasie 10/xg/ml~lOOjug/ml is, word bloedplaatjie-aggregasie heeltemal geïnhibeer.Indien gewasde bloedplaatjies as materiaal gebruik is, kon PLA2 nie aggregasie by die konsentrasie van 20Mg/ml inhibeer nie.Aspirien is 'n inhibeerder van siklooksigenase, wat die effek van PLA2 op bloedplaatjies kan inhibeer.PLA2 kan bloedplaatjie-aggregasie inhibeer deur arakidonsuur te hidroliseer om tromboksaan A2 te sintetiseer.Die oplossingskonformasie van PLA2 geproduseer deur Agkistrodon halys Pallas gif in Zhejiang Provinsie is bestudeer deur middel van sirkelvormige dichroïsme, fluoressensie en UV-absorpsie.Die eksperimentele resultate het getoon dat die hoofkettingkonformasie van hierdie ensiem soortgelyk was aan dié van dieselfde soort ensiem van ander spesies en genera, die skeletkonformasie het goeie hittebestandheid gehad, en die strukturele verandering in suur omgewing was omkeerbaar.Die kombinasie van aktiveerder Ca2+ en ensiem beïnvloed nie die omgewing van triptofaanreste nie, terwyl die inhibeerder Zn2+ die teenoorgestelde doen.Die manier waarop pH-waarde van oplossing ensiemaktiwiteit beïnvloed, verskil van die bogenoemde reagense.
In die proses van PLA2-suiwering van slanggif, is 'n ooglopende verskynsel dat 'n slanggif twee of meer PLA2-elueringspieke bevat.Hierdie verskynsel kan soos volg verduidelik word: ① as gevolg van die bestaan van isosime;② Een soort PLA2 word gepolimeriseer in 'n verskeidenheid PLA2-mengsels met verskillende molekulêre gewigte, waarvan die meeste in die reeks van 9 000~40 000 is;③ Die kombinasie van PLA2 en ander slanggifkomponente bemoeilik PLA2;④ Omdat die amiedbinding in PLA2 gehidroliseer word, verander die lading.① En ② is algemeen, met slegs 'n paar uitsonderings, soos PLA2 in CrWa/w slanggif
Daar is twee situasies: ① en ②.Die derde toestand is gevind in PLA2 in die gif van die volgende slange: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Palestynse adder, sandadder en verskriklike ratelslang km.
Die resultaat van geval ④ laat die migrasiespoed van PLA2 tydens elektroforese verander, maar die aminosuursamestelling verander nie.Peptiede kan deur hidrolise gebreek word, maar oor die algemeen word hulle steeds deur disulfiedbindings saamgebind.Die gif van die oostelike put ratelslang bevat twee vorme van PLA2, onderskeidelik tipe a en tipe p PLA2 genoem.Die verskil tussen hierdie twee tipes PLA2 is slegs een aminosuur, dit wil sê, glutamien in een PLA2-molekule word vervang deur glutamiensuur in die ander PLA2-molekule.Alhoewel die presiese rede vir hierdie verskil nie duidelik is nie, word daar algemeen geglo dat dit verband hou met die deaminering van PLA2.As PLA2 in die Palestynse addergif saam met die ru-gif warm gehou word, sal die eindgroepe in sy ensiemmolekules meer word as voorheen.Van C PLA2 geïsoleer van slanggif het twee verskillende N-terminaal, en sy molekulêre gewig is 30000. Hierdie verskynsel kan veroorsaak word deur die asimmetriese dimeer van PLA2, wat soortgelyk is aan die simmetriese dimeer wat deur PLA2 in die gif van oostelike diamantrug ratelslang gevorm word en westerse diamantrug ratelslang.Die Asiatiese kobra bestaan uit baie subspesies, waarvan sommige nie baie definitief in klassifikasie is nie.Byvoorbeeld, wat vroeër die Cobra Buite Kaspiese subspesie genoem is, word nou erken
Dit moet toegeskryf word aan die Kobra van die Buitenste Kaspiese See.Aangesien daar baie subspesies is en hulle saam gemeng word, verskil die samestelling van slanggif baie as gevolg van verskillende bronne, en die inhoud van PLA2-isosieme is ook hoog.Byvoorbeeld, kobra-gif
Minstens 9 soorte PLA2-isosieme van r ^ ll spesies is gevind in, en 7 soorte PLA2-isosieme is gevind in die gif van kobra-subspesies Caspian.Durkin et al.(1981) het die PLA2-inhoud en die aantal isosime in verskillende slanggifstowwe bestudeer, insluitend 18 kobra-gifstowwe, 3 mamba-gifstowwe, 5 addergifstowwe, 16 ratelslanggifstowwe en 3 seeslanggifstowwe.Oor die algemeen is die PLA2-aktiwiteit van kobragif hoog, met baie isosime.Die PLA2-aktiwiteit en isosime van addergif is medium.Die PLA2-aktiwiteit van mamba-gif en ratelslanggif is baie laag of geen PLA2-aktiwiteit nie.Die PLA2-aktiwiteit van seeslanggif is ook laag.
In onlangse jare is daar nie gerapporteer dat PLA2 in slanggif in die vorm van aktiewe dimeer bestaan nie, soos die oostelike rhombophora ratelslang (C. slanggif bevat tipe a en tipe P PLA2, wat albei uit twee identiese subeenhede saamgestel is , en net dimerase het
Aktiwiteit.Shen et al.het ook voorgestel dat slegs die dimeer van PLA2 van die slanggif die aktiewe vorm van die ensiem is.Die studie van ruimtelike struktuur bewys ook dat PLA2 van westelike diamantrug ratelslang in die vorm van dimeer bestaan.Vissende samestelling
Daar is twee verskillende PLA ^ Ei en E2 van slanggif, waarin 仏 in die vorm van dimeer bestaan, die dimeer aktief is en die gedissosieerde monomeer daarvan onaktief is.Lu Yinghua et al.(1980) het verder die fisiese en chemiese eienskappe en reaksiekinetika van E. Jayanthi et al.(1989) het 'n basiese PLA2 (VRVPL-V) van die addergif geïsoleer.Die molekulêre gewig van die monomeer PLA2 is 10000, wat dodelike, antikoagulerende en edeem-effekte het.Die ensiem kan polimere met verskillende molekulêre gewigte polimeriseer onder die toestand van PH 4.8, en die graad van polimerisasie en molekulêre gewig van polimere neem toe met die toename in temperatuur.Die molekulêre gewig van die polimeer wat by 96 ° C gegenereer word, is 53 100, en die PLA2-aktiwiteit van hierdie polimeer neem toe met twee
Postyd: 18 Nov 2022